微生物測定的發展

      微生物生長情況可以通過測定單位時間里微生物數量或生物量(biomass)的變化來評價。通過微生物生長的測定可以客觀地評價培養條件、營養物質等對微生物生長的影響，或評價不同的抗菌物質對微生物產生抑制(或殺死)作用的效果，或客觀地反映微生物生長的規律。因此微生物生長的測量在理論上和實踐上有著重要的意義。微生物生長的測定有計數、重量和生理指標等方法。

1、計數法

      此法通常用來測定樣品中所含細菌、孢子、酵母菌等單細胞微生物的數量。計數法又分為直接計數和間接計數兩類。

直接計數
      這類方法是利用特定的細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。此法的缺點不能區分死菌與活菌。計數板是一塊特制的載玻片，上面有一個特定的面積lmm2和高0.1mm的計數室，在1mm2的面積里又被刻劃成25個(或16個)中格，每個中格進一步劃分成16個(或25個)小格，但計數室都是由400個小格組成。

      將稀釋的樣品滴在計數板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計算4-5個中格的細菌數，并求出每個小格所含細菌的平均數，再按下面公式求出每毫升樣品所含的細菌數。

      每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數×400×l000×稀釋倍數

間接計數法
      又稱活菌計數法，其原理是每個活細菌在適宜的培養基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。將待測樣品經一系列10倍稀釋，然后選擇三個稀釋度的菌液，分別取0.2ml無菌平皿，再倒入適量的已熔化并冷至45℃左右的培養基，與菌液混勻、冷卻、待凝固后，放人適宜溫度的培養箱或溫室培養，長出菌落后，計數，按下面公式計算出原菌液的含菌數：

      每毫升原菌液活菌數＝同一稀釋度三個以上重復平皿菌落平均數×稀釋倍數×5

      此法可因操作不熟練造成污染，或因培養基溫度過高損傷細胞等原因造成結果不穩定。盡管如此，由于該方法能測出樣品中微量的菌數，仍是教學、科研和生產上常用的一種測定細菌數的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽孢與孢子等的數量均可用此法測定。但不適于測定樣品中絲狀體微生物，例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營養體等。

      除上述兩種常用的計數方法外，還有膜過濾法、比濁法。膜過濾法是當樣品中菌數很低時，可以將一定體積的潮水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上(或一定面積中)的細菌數；比濁法原理是在一定范圍內，菌的懸液中細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度計，在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度(optical density，即O..D.)表示菌量。實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內，否則不準確。微生物計數法，發展迅速，現有多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法。

2、重量法
      此法的原理是根據每個細胞有一定的重量而設計的。它可以用于單細胞、多細胞以及絲狀體微生物生長的測定。將一定體積的樣品通過離心或過濾將菌體分離出來，經洗滌，再離心后直接稱重，求出濕重，如果是絲狀體微生物，過濾后用濾紙吸去菌絲之間的自由水，再稱重求出濕重。不論是細菌樣品還是絲狀菌樣品，可以將它們放在已知重量的平皿或燒杯內，于105℃烘干至恒重，取出放人干燥器內冷卻，再稱量，求出微生物干重。

      如果要測定固體培養基上生長的放線菌或絲狀真菌，可先加熱至50℃，使瓊脂熔化，過濾得菌絲體，再用50℃的生理鹽水洗滌菌絲，然后按上述方法求出菌絲體的濕重或干重。

      除了干重、濕重反映細胞物質重量外，還可以通過測定細胞中蛋白質或DNA的含量反映細胞物質的量。蛋白質是細胞的主要成分，含量也比較穩定，其中氮是蛋白質的重要組成元素。從一定體積的樣品中分離出細胞，洗滌后，按凱氏定氮法測出總氮量。蛋白質含氮量為16%，細菌中蛋白質含量占細菌因形物的50%一80%，一般以65%為代表，有些細菌則只占13%一14%，這種變化是由菌齡和培養條件不同所產生的。因此總含氮量與蛋白質總量之間的關系可按下列公式計算：

      蛋白質總量＝含氮量×6.25
      細胞總量＝蛋白質總量÷(50%～80%(或65%))≈蛋白質總量×1.54

      核酸DNA是微生物的重要遺傳物質，每個細菌的DNA含量相當恒定，平均為8.4×10-5ng.因此從一定體積的細菌懸液中所含的細菌中提取DNA，求得DNA含量，再計算出這一定體積的細菌懸液所含的細菌總數。

3、生理指標法
      對于一些非真溶液的樣品，要測定微生物數量除了用活菌計數法外，還可以用生理指標測定法進行測定。生理指標包括微生物的呼吸強度、耗氧量、酶活性、生物熱等。這是根據微生物在生長過程中伴隨出現的這些指標，樣品中微生物數量多或生長旺盛，這些指標愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等設備來測定相應的指標。這類測定方法主要用于科學研究，分析微生物生理活性等。